团队介绍

实习小队：疫控实习小队

团队成员：鲁然 杨楠 周雨姗 董林俐 刘沁 张姜婧 张莹莉 蔡宜炯 黄雨欣 张屿璠

带队老师：张丹，吴炯

实习地点：天津市动物疫病预防控制中心

（一）公共卫生科

（1）对已采集的病鱼进行解剖

在无菌的条件下对患病鲫鱼进行解剖,使用开天窗的方式将鱼的内脏暴露出来，用酒精棉球消毒分别取肝脾肾的部分组织，在平板上划线，放培养箱中进行培养，目的是分离可能存在的病原体，经过24小时培养后，可观察到肝脾肾均有细菌生长。

按照比例配制培养基后，放入高压灭菌锅中进行高温高压灭菌，之后在生物安全柜中倒平板、制作固体培养基。

（3）细菌性病原检测

①将细菌分离纯化,观察菌落的形态特点。如鲫鱼嗜水气单胞菌的菌落为圆形半透明，颜色为灰白色至淡黄色，表面光滑湿润。

②挑取单菌落加30μL无菌水混匀水浴加热提取DNA,用16s引物配置50μL体系,进行16s扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析电泳产物图,得到其DNA片段分子量和纯度。ps：耐药基因的检测要用gyrb作为引物并选择gyrb进行扩增。

（4）药敏试验

将多西环素、氟苯尼考、恩诺沙星等抗菌药物进行一系列倍比稀释，与菌悬液在96孔板中混合培养，观察细菌生长情况，确定抑制细菌生长的最低药物浓度，即MIC值（最小抑菌浓度）。

（5）生化鉴定

用微生物检测卡对单菌落进行生化鉴定,必要时进行补充鉴定,例如葡萄糖产气实验,MR-VP实验。通过鉴定结果可以判断细菌种类和特性。如气单胞菌生化鉴定可通过观察葡萄糖是否产气来区分嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌。

（二）疾病追溯流调科

（1）采样和水质检测

①4月至5月期间,由老师从武清、北辰、宝坻各个养殖基地取的水样和水产品带回实验室进行分析。

②用水质检测盒检测水样的pH、氨氮、溶解氧、总碱度、总硬度、磷酸盐等指标。例如某个水样测的的水质数据为pH为7.8，溶解氧为6mg/L，氨氮为0.5mg/L，亚硝酸盐为0.2mg/L，总硬度为78德国度，总碱度为80等。

（2）样品处理

①针对于不同时期的虾苗，采用直接将虾苗捣碎或取肝胰腺和鳃丝组织进行研磨制成组织液，后续再吸取200微升提取核酸，核酸作为模版进行检测。

②针对于患病螃蟹，采用接种环接种病害部位进行平板画线培养病害菌，再将分离纯化后的细菌进行PCR扩增。

③针对于不同鱼类和需要检测的疾病，有选择性的采取不同组织进行核酸的提取。

ps：对于提纯的细菌还需做药敏试验，通过测量抑菌圈的大小来判断细菌对药物的敏感性。

（3)PCR扩增和电泳

①将制备好的细菌模版加入对应引物及其他试剂，放入PCR扩增仪器进行扩增。

②将PCR之后的产物进行电泳，分析电泳产物图来初步判定是否患病，在对应的区间出现明亮的条带则初步判定该病原为阳性。

ps：针对于一些病毒病还可通过荧光PCR进行判定，若样品呈现“S”型曲线则初步判定为阳性。

（三）疫病应急科

（1）采样和水质检测

在天津宝坻区养殖扶持区采集养殖河蟹样本十几只，带回实验室检测是否感染WSSV。用纳氏试剂比色法测定水体氨氮含量；用分光光度法测定水体亚硝酸盐氮浓度（本次仅用氨氮、亚硝酸盐氮标准溶液练习）。

（2）生物样品处理

取部分样品放入研磨管中：虾苗直接研磨；患病鱼取病灶处、鳃部、肠道内容物等；螃蟹或虾取肝胰腺。

（3）显微镜观察

取病灶处、鳃、肠道内容物等制作水压片，在显微镜下观察有无病菌、寄生虫；在患病鲈鱼送样检测中，取其部分鳃丝制作水压片，观察发现其鳃丝粘连且有许多车轮虫寄生。

（3）生物样品病原检测

①用核酸提取试剂盒或CTAB法提取DNA和RNA；

②从样品中接种、平板划线进行病菌分离、纯化，然后挑取目标单菌落制成菌液；

③定性：配置反应体系，进行PCR，然后通过琼脂糖凝胶电泳观察条带，确定目标基因是否存在；

④定量：根据要检测的目的病原（WSSV、IHHNV、EHP、DIV1、AHPND、IMMNV、CMNV、KHV）选择特异性探针，配好体系后进行qPCR，根据生成的曲线来计算目标核酸的含量；

检测结果要依照国家标准来判定，如鲤疱疹病毒（CyHV-2），在CyHV、CyHV-2引物对应位置均出现条带才能鉴定为阳性。

在超净工作台分离EPC细胞后放入恒温箱培养，每天进行换液；细胞在倒置培养基中贴壁生长，长满后将贴壁细胞冲落混匀，离心后放入冻存管冷冻；成熟健康的EPC细胞呈鹅卵石样排列，轻轻敲动显微镜，可观察到细胞已贴在下壁不动。

实习的时光转瞬即逝，在老师们的认真指导和帮助下，我们学习并熟悉了各项实验操作流程，我们收获了许多，学习到了新的知识，这是一个把书本上的理论知识运用于实践的好机会,让我们也深深的体会到了理论和实践是密不可分的。非常感谢疫控中心和学院让我们拥有了这次宝贵的实习经历,给我们一个接触一线的机会。这段经历让我们对动疫防控从“纸上认知”变成了“心中敬畏”，原来每个细微的工作，都藏着对生命的尊重、对行业的担当。